馬杰教授：新時代下，融合基因檢測應如何為非小細胞肺癌患者精準治療領航

融合基因是指兩個不同基因的部分或全部序列相連形成的新混合基因，其編碼產生的融合蛋白能夠介導腫瘤的發生發展。基因融合是NSCLC中一類重要的分子變異，在NSCLC中的發生率為8%~12%，近十余年來，針對融合基因的靶向治療進展迅速，已有多種針對不同基因融合的酪氨酸激酶抑制劑（TKI）獲批用于臨床治療，融合基因陽性的晚期NSCLC患者可從相應靶向治療中顯著獲益1。NSCLC中的融合基因包括ALK、ROS1、RET和NTRK等，目前我國已有多個特異性融合靶點TKI藥物獲批。

ROS1基因融合是一種獨特的受體酪氨酸激酶，與ALK同屬胰島素樣受體酪氨酸激酶超家族成員，二者氨基酸序列上具有近49％的相似性，在激酶催化區的ATP結合位點同源性高達77％，且在臨床特征上也非常相似。ROS1基因融合在NSCLC中的發生率為1.0％～3.4％2。截止目前，小分子TKI克唑替尼和恩曲替尼已獲美國食品藥品監督管理局（FDA）和國家藥品監督管理局（NMPA）批準用于ROS1融合陽性NSCLC的一線治療。此外，全球還有多款新藥被開發用于治療ROS1陽性NSCLC，如瑞普替尼（Repotrectinib）、Taletrectinib和洛拉替尼等3。

其中，瑞普替尼作為新一代潛在“best-in-class”ROS1和NTRK靶向抑制劑，具有獨特的剛性大環結構，使其能夠更加精準地將分子錨定在ATP結合位點上，帶來高選擇性、高親和力的特點，進而提高療效。在2022年分子靶點和癌癥治療研討會（ENA）中，研究者公布了I/II期研究TRIDENT-1的結果?。研究顯示，在ROS1-TKI初治隊列（EXP-1，n=71）中，經確認的客觀緩解率（ORR）為78.9%，4例患者（5.6%）達到完全緩解（CR），52例患者（73.2%）達到部分緩解（PR），臨床獲益率（CBR）為94.4%（圖1）。12個月的DOR率（n=56）和PFS率（n=71）分別為86.1%和79.7%。

圖1. EXP-1：ROS1 TKI初治隊列的臨床活性

既往接受1種ROS1 TKI和1種含鉑化療的經治隊列（EXP-2）共納入26例患者，ORR達42.3%，CBR為73.1%。6個月的DOR率和PFS率分別為63.6%和38.9%（圖2）。

圖2. EXP-2：既往接受1種ROS1 TKI和1種含鉑化療的經治隊列的臨床活性

既往接受2種ROS1 TKI且未經化療的經治隊列（EXP-3）共納入18例患者，ORR為27.8%，CBR為44.4%。6個月的DOR率和PFS率分別為60.0%和22.2%（圖3）。

圖3. EXP-3：既往接受2種ROS1 TKI且未經化療的經治隊列的臨床活性

既往接受1種ROS1 TKI且未經化療的經治隊列（EXP-4）共納入56例患者，ORR為37.5%，CBR達82.1%（圖4）。6個月的DOR率和PFS率分別為79.5%和67.4%。

圖4. EXP-4：既往接受1種ROS1 TKI且未經化療的經治隊列的臨床活性

在ROS1 TKI經治患者中，共有17例基線伴G2032R溶劑前沿突變，經BICR評估的ORR達58.8%，CBR為70.6%，6個月的DOR率為70.0%（圖5）。

圖5. 伴ROS1 G2032R耐藥突變的ROS1 TKI經治患者的臨床活性

TRIDENT-1研究提示，瑞普替尼在ROS1 TKI初治和經治的ROS1融合陽性晚期NSCLC患者中均表現出持久的臨床療效，包括ROS1 G2032R耐藥突變患者。基于該研究的優異數據，瑞普替尼治療ROS1陽性局部晚期或轉移性NSCLC成人患者的上市申請已被國家藥品監督管理局藥品審評中心（CDE）受理并納入優先審評，這一舉措將加速瑞普替尼在國內的上市進程。期待瑞普替尼盡早上市，在臨床實踐中為患者帶來更好的生存獲益。

準確檢測出融合基因是個體化治療的前提，《NCCN非小細胞肺癌臨床實踐指南（2023年v3版）》和《CSCO非小細胞肺癌診療指南（2023版）》均推薦NSCLC患者在治療前應進行ALK、ROS1、RET、NTRK等融合基因檢測3^,?。基因融合的形成機制多樣復雜，主要通過染色體結構在DNA層面形成基因重排，轉錄后經過剪接形成新的mRNA，并翻譯成特殊的融合蛋白。根據DNA層面融合斷點位置的不同，基因重排可分為基因內重排、基因間重排和混合性融合1。此外，部分DNA層面重排不會產生mRNA和融合蛋白。這些多樣的融合機制導致了其臨床檢測的相對復雜性。

目前常見的融合基因檢測方法包括：免疫組化（IHC）、熒光原位雜交（FISH）、逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）和下一代測序（NGS）等1。

IHC是基于蛋白的基因融合檢測方法，具有靈敏度高、成本低、檢測時間短、易于自動化的特點，但其準確性取決于檢測的融合蛋白是否有經過驗證的抗體， ALK 融合的免疫組化一致性較高，其他融合檢測中IHC僅用于初篩，陽性結果還需其他檢測方法進行驗證。

FISH技術利用熒光標記的特異核酸探針與細胞內相應的靶DNA分子雜交，通過觀察熒光信號，來確定目標基因分離或融合狀態。FISH檢測靈敏度和特異度較高，是融合檢測的“金標準”，但該方法不能明確融合伴侶基因信息，且對罕見變異類型可能存在假陰性結果，例如GOPC?ROS1融合。此外，FISH檢測方法通量較低，每次只能檢測某一種類型的融合，且檢測成本相對較高，臨床應用具有一定的局限性。

RT?PCR可在RNA層面檢測基因融合，優勢在于檢測周期相對較短（2~3天），簡便易行，靈敏度和特異度較高，能同時明確已知的融合變異類型，是目前院內病理科最為常用的融合檢測平臺。RT?PCR可覆蓋絕大部分融合基因類型，僅少部分低頻罕見融合伴侶未覆蓋。

NGS根據檢測基因分子的類型不同分為基于DNA水平或RNA水平進行基因融合檢測，具有樣本限制較少、靈敏度和特異度高、通量大等優點。

根據融合基因序列特點，融合基因在RNA水平上檢測比DNA水平更敏感。以ROS1融合為例，多個研究及多家檢測公司發現，僅使用DNA-NGS會降低融合基因的檢出率，若補充RNA-NGS檢測，可額外檢出20%~30%的ROS1融合?^,?（圖6）。

圖6. 使用ARMS-PCR+IHC、DNA-NGS和RNA-NGS檢測驅動基因改變

DNA-NGS是臨床常用的檢測方法，目前國內對于融合基因的檢測也主要以DNA-NGS為主，但對于融合基因的判定可能會出現假陰性。另外，還有一小部分融合基因僅能在DNA水平上檢出，無法形成有功能的融合RNA，臨床相關性差，患者靶向治療獲益不佳。RNA-NGS作為有效補充方法，可有效提升臨床融合基因的檢測準確性，讓更多的患者有機會使用對應的靶向治療藥物，但目前國內RNA-NGS使用率較低。

除NGS外，FISH最初是融合基因檢測的金標準，但多項研究已顯示敏感度不如RT-PCR，而且常規IHC和FISH均受主觀因素影響?^,?。RT-PCR作為基于RNA水平的融合基因檢測方法，臨床應用率僅次于NGS，目前國內多個檢測公司已上市相關試劑盒。此外，不同的檢測方法檢出的融合陽性率存在一定差異。例如，RT-PCR在中國NSCLC患者中檢出的ROS1融合陽性率為2.59%1?，而NGS檢出的ROS1融合陽性率則為1.56%?。值得一提的是，NGS對于DNA和RNA樣本要求較高，從而導致檢測失敗率較高，有日本研究顯示，艾德11基因RT-PCR的檢測失敗率為1.5%，而NGS則為12.2%11，若為RNA-NGS，則失敗率可能會更高，這也為臨床使用NGS檢測提出了挑戰。

在臨床實踐中，基因融合復雜多變，檢測中存在各種困難，多種檢測方法各具有優缺點。臨床醫生應根據送檢標本類型、腫瘤細胞含量、標本質量、所檢融合基因特點、平臺可及性、檢測周期及費用等因素，針對融合檢測制定優化策略，合理選擇檢測平臺及方式，必要時可多平臺互補和驗證，有效提高融合檢出率及可靠性，避免漏檢錯檢。

由于基因融合/重排發生的斷點并不固定且斷點類型較多，因此DNA層面檢測較為困難。RNA- NGS可克服DNA水平融合檢測存在的挑戰，提高融合變異的檢出率，臨床醫生可優先選擇基于RNA水平的檢測方法，如RNA-NGS、RT-PCR。

目前國內主要以DNA-NGS檢測為主，當臨床上采用基于DNA水平的方法檢測時，若未檢出融合基因陽性，應考慮補充基于RNA水平的檢測，避免漏檢。《少（罕）見驅動變異陽性肺癌診療共識》指出，對于少（罕）見驅動基因的檢測，推薦大panel的DNA-NGS作為首選，RNA-NGS作為補充；測序基因panel至少應包括不少于50個基因的1類變異。今年6月剛發布的《非小細胞肺癌融合基因檢測臨床實踐中國專家共識（2023版）》同樣強烈推薦DNA層面檢出的罕見融合伴侶、外顯子斷點融合及基因間融合應在RNA或蛋白水平進一步驗證1。此外，對于經過廣泛基因檢測未發現驅動基因突變的患者，《NCCN非小細胞肺癌臨床實踐指南（2023年v3版）》推薦進行RNA-NGS檢測?（圖7）。

圖7. 2023 V3 NCCN非小細胞肺癌診療指南-分子和生物標志物分析