最全總結丨關于液體活檢，你想知道的都在這里

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液體活檢知多少？

目前液體活檢在國內的應用情況如何？

腫瘤的液體活檢主要包括循環腫瘤DNA（即circulating tumor DNA，ctDNA）、游離腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）及外泌體（exosome）。眾多研究表明三者與腫瘤的早診、治療、預后等均存在相關性。目前在臨床應用最多的當屬ctDNA檢測。

正常人的體液內亦存在來自于機體正常細胞的游離DNA，簡稱循環游離DNA；在腫瘤患者體內，循環游離DNA不僅僅來自于正常細胞，還有一部分來自于腫瘤細胞，即ctDNA是循環游離DNA的一部分，因此我們可以通過檢測ctDNA相關變異狀態作為來自腫瘤細胞的標志物。目前臨床腫瘤ctDNA檢測最常見的應用領域為治療方案選擇及耐藥監測。

由于ctDNA具有片段化程度高、豐度低等特點，其主流檢測方法包括Cobas法、Super-ARMS法、高通量二代測序（NGS）及數字PCR。

Cobas檢測：作為第一個被美國食品藥品監督管理局（FDA）批準的ctDNA檢測試劑盒，僅對血液ctDNA中的EGFR基因常見突變進行檢測，在以上四種ctDNA常用檢測方法中敏感度較低；

Super-ARMS法：僅對EGFR基因常見突變進行檢測，其通過對傳統擴增阻遏突變系統（Amplification Refractory Mutation System，ARMS）法的優化升級，靈敏度更高，可檢測低至0.2%豐度的突變，并且于2018年通過中國藥監局審批；

NGS：優點在于可同時檢測多個基因相關變異，能在最短的時間內對患者腫瘤變異情況做出全面了解，缺點在于操作復雜，費用較為昂貴；

數字PCR檢測：為目前最敏感的檢測方法，可以識別低至0.03%的突變，但是缺點在于檢測通量低，每次僅能檢測一個位點，并且僅能檢測已知位點的突變。

哪些情況下適合采用液體活檢？

要了解液體活檢具體的應用場景，首先應明確液體活檢的優劣勢。

液體活檢最大的優勢在于微創、快捷，易于動態監測；一定程度上全面反映腫瘤整體變異狀態，不受腫瘤異質性影響；適用人群更廣泛，對于難以取得活檢腫瘤組織或取得腫瘤組織不夠基因檢測的患者，液體活檢提供了一個了解腫瘤基因變異狀態的有效途徑。

然而，液體活檢最大的劣勢在于其并非富集腫瘤的檢材，大量的正常組織釋放基因組DNA稀釋了腫瘤來源的DNA，造成ctDNA突變豐度很低（一般低于1%），對ctDNA突變的檢測無異于大海撈針，或者更形象地說：從一堆稻草（正常組織來源的循環游離DNA）中找一根針（來自腫瘤細胞的ctDNA）一樣困難，因此對ctDNA的檢測方法靈敏度提出了更高的要求。

1. 早期診斷

腫瘤的早期診斷其最大特點為腫瘤負荷很低，可能影像學上都沒有明確的腫瘤病灶。此時血液中ctDNA的含量亦極低，普通針對ctDNA突變的檢測難以滿足早診的要求。

值得慶幸的是，細胞從癌前狀態向癌癥發展過程中，DNA甲基化改變是貫穿整個惡性轉化的表觀遺傳學改變。即使在腫瘤發展的最早期階段，DNA甲基化模式也已經與正常細胞存在顯著差異；其次，甲基化水平的改變是具有組織特異性的，即對甲基化進行檢測及比對，能夠進行器官溯源，發現到底是哪里可能會發生或已經發生了腫瘤。

因此，對ctDNA的甲基化水平進行檢測，是一種有效的腫瘤早期篩查輔助手段。比如SEPT9基因甲基化檢測試劑盒對結直腸癌診斷的敏感度及特異性可達74.8%及97.5%^[1]，現在已經可以作為一種結腸鏡前的初篩手段。

2. 指導靶向治療

腫瘤的靶向治療是目前臨床最常見的ctDNA檢測應用場景。根據《非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識》^[2]，如果有腫瘤組織，推薦直接用腫瘤組織進行驅動基因檢測；但是若沒有腫瘤組織樣本或者腫瘤組織樣本不足的情況下，液體活檢可作為很多患者基因檢測的首選。

由于中國非小細胞肺癌人群中EGFR為最常見的驅動基因變異（約40%-55%），此時對腫瘤驅動基因的檢測，既可以使用Cobas或者Super-AMRS法對EGFR基因常見突變進行檢測，也可以使用NGS，一次性對所有肺癌相關驅動基因變異進行全面檢測。

但無論是何種檢測方式，應注意的是若組織活檢或者液體活檢有任何一個是陽性，患者就應當考慮使用靶向藥物；當液體活檢先行的時候，若液體活檢為陰性，應提示患者可能存在假陰性，必要時再取活檢，以避免錯失可能的靶向治療機會。

3. 耐藥監測

靶向治療終歸面臨耐藥的問題，而液體活檢由于微創快捷的優勢，是理想的耐藥監測材料。對于EGFR一代或者二代TKI用藥人群，約半數以上的患者出現EGFR 20號外顯子T790M而耐藥^[3]，因此對于此類患者的耐藥監測可使用敏感度高且成本低的數字PCR法對T790M單點進行監測。如果患者已經出現了耐藥，亟需探索其耐藥機制以更換治療方案，此時推薦使用NGS對基因變異的整體狀態進行檢測，以便全面尋找耐藥原因。

4. 預后評估

在預后評估方面，微小殘留病變（MRD）是目前研究的熱點。MRD指的是治療后傳統影像學和實驗室方法無法發現，但通過分子診斷可以發現的腫瘤來源的分子異常。多種腫瘤的相關研究表明，ctDNA突變狀態可提示接受根治性治療的患者的預后復發，并且已經在部分臨床實驗中得到應用。

但是正如2021年發表于循證醫學的《引領肺癌治療新時代的標記物——微小殘留病灶》述評^[4]中指出的，MRD檢測還面臨諸多問題，比如用何種方法來進行ctDNA MRD檢測，如何兼顧靈敏度和成本效益，用何種標準來進行判讀等。如今大部分肺癌相關臨床試驗突出的是MRD的陽性預測價值，而將MRD作為治療預測標記物的研究并不多。

// 要點提示 //

由于液體活檢具有微創、方便、易于重復等特點，因此在療效監測、MRD評估及耐藥機制上有著組織活檢所不可比擬的優勢。在臨床上，當患者無法獲取腫瘤組織或者腫瘤組織不夠基因檢測的時候，液體活檢為了解患者基因變異狀態打開了一扇窗戶。

但是，無論是何種高靈敏度液體活檢檢測手段，都有假陰性的問題。因此我們應時刻提示自己，對于液體活檢檢測陰性的患者，應當結合其組織活檢狀態、臨床表現等綜合分析。此外，我們也應當根據臨床應用場景，選擇合適的液體活檢檢測方法，在滿足患者需求的同時，達到快速、準確的檢測目的。

血液樣本送檢有哪些注意事項？

血液的規范化處理是保證液體活檢結果準確的基本前提。在血液樣本的送檢方面應注意以下幾點：

1. 采血管的選擇

用于ctDNA檢測的血液需使用EDTA抗凝管或者cfDNA專用采血管。若使用EDTA抗凝管，血液離體后應盡量保存于4℃，2小時內需盡快進行血漿分離；若使用cfDNA專用采血管，血液可在常溫保存3-5天。切記嚴禁使用肝素抗凝管，因為肝素在后續DNA提取過程中難以去除，并且會抑制PCR反應，導致后續ctDNA檢測失敗。

2. 采血量及采血注意事項

一般而言，ctDNA檢測需要采集8-10ml的全血^[2]。采血后嚴禁劇烈震蕩血液，或者使用注射器針頭對血液進行轉移，因為這樣的操作均會導致血液中細胞破裂，從而造成基因組DNA的污染，增加ctDNA檢測的假陰性；此外溶血造成血紅蛋白及其代謝產物的大量釋放，從而抑制PCR擴增效率。采血后應輕柔將采血管顛倒8-10次進行混勻。

3. 患者采血時間的選擇

一般建議患者空腹進行抽血，特別是血脂較高的患者。這是由于低密度脂蛋白對熒光有屏蔽和吸收的作用，會干擾后續ctDNA的相關檢測；三酰甘油會降低ctDNA的提取率；若使用微滴式數字PCR檢測技術，血液中的脂質會影響后續微滴的生成。此外，對于正在進行化療的患者，一般建議患者化療結束后進行抽血。

罕見靶點檢測如何選擇合適的檢測方法？有哪些注意事項？

肺癌的罕見靶點主要指的是發生率低于5%的驅動基因變異。雖然發生率低，但是結合我國肺癌人群的龐大基數，此部分患者數量依然眾多。由于這部分驅動基因變異的發生率較低，結合衛生經濟學、腫瘤組織量的限制及檢測流轉時間（turn around time）的要求，推薦使用NGS技術來進行罕見靶點的檢測。

應注意的是，選擇NGS對罕見靶點進行檢測時，應注意選擇panel的大小及是否覆蓋所需要檢測的靶點；ALK、ROS1、RET等基因的融合，應注意panel對融合基因的內含子的覆蓋度（因為融合斷裂點大多數位于內含子，內含子覆蓋度低可能造成融合檢測的假陰性）；對于基于DNA NGS測出的罕見融合，或者DNA NGS檢測驅動基因全陰性但臨床高度懷疑存在驅動基因變異的人群，建議有條件的話使用RNA NGS進行進一步驗證^[5]。

專家簡介

李研 醫學博士

中國醫學科學院腫瘤醫院

中國抗癌協會腫瘤病理專委會腫瘤分子病理協作組委員

北京腫瘤防治研究會轉化醫學分委會常務委員

北京整合醫學學會肺癌專委會委員

北京腫瘤病理精準診斷研究會青委會委員

主持腫瘤分子病理相關的國家自然科學基金青年課題一項，市局級課題兩項，作為課題骨干參與國家重點研發計劃一項；曾獲“北京地區廣受關注學術論文”、“中國醫學科學院北京協和醫學院第三屆青年科技人員創新論壇優秀獎”、“中國抗癌協會腫瘤病理專委會中國腫瘤大會優秀論文”等獎項。

參考文獻：

[1]Jin P, Kang Q, Wang X, Yang L, Yu Y, Li N, et al. Performance of a second-generation methylated SEPT9 test in detecting colorectal neoplasm. Journal of gastroenterology and hepatology. 2015 May;30(5):830-3. PubMed PMID: 25471329.

[2]吳一龍. 非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識. 中華醫學雜志. 2015.

[3]O’Kane GM, Barnes TA, Leighl NB. Resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors, T790M, and clinical trials. Current oncology. 2018 Jun;25(Suppl 1):S28-S37. PubMed PMID: 29910645. Pubmed Central PMCID: 6001758.

[4]張嘉濤, 楊學寧, 吳一龍. 引領肺癌治療新時代的標志物——微小殘留病灶. 循證醫學. 2021;21(1):5.

[5]Li W, Guo L, Liu Y, Dong L, Yang L, Chen L, et al. Potential Unreliability of Uncommon ALK, ROS1, and RET Genomic Breakpoints in Predicting the Efficacy of Targeted Therapy in NSCLC. Journal of thoracic oncology : official publication of the International Association for the Study of Lung Cancer. 2021 Mar;16(3):404-18. PubMed PMID: 33248323.