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論NSCLC的ALK檢測手段，談基因檢測的研究進展。
ALK融合基因在我國非小細胞肺癌（NSCLC）中的發生率約5.6%，其中腺癌的發生率為6.6%~9.6%[1]。近年來ALK抑制劑的研發和臨床應用取得了較大的突破，ALEX試驗更新了二代ALK抑制劑阿來替尼一線對比一代抑制劑克唑替尼治療ALK陽性NSCLC患者的總生存期（OS）數據，結果顯示阿來替尼的5年OS率為62.5%，HR=0.67，較克唑替尼具有更顯著的臨床獲益[2]。
因此，選擇準確、快速、恰當的ALK檢測方法，篩選出適用ALK抑制劑的目標人群具有重要臨床意義[1]。
當前ALK基因的檢測手段眾多，其中，熒光原位雜交技術（FISH）可在DNA水平上檢測ALK基因易位；免疫組織化學（IHC）能夠檢測ALK融合蛋白表達；即時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）可檢測ALK融合mRNA；二代測序（NGS）技術可檢測DNA水平或mRNA水平上的融合序列[1]。
因此，針對不同檢測人群、檢測標本，選擇恰當的檢測方法，并制定、優化及遵守規范化檢測流程以獲得準確的檢測結果，進而指導ALK陽性（ALK+）患者靶向用藥，可使患者得到最大程度的臨床獲益。
解讀ALK融合基因的IHC、FISH、RT-PCR和NGS檢測
ALK Ventana-D5F3 IHC檢測方法是目前最快速、經濟的方法，且結果判讀標準簡單，具有較高的靈敏度（100%）及特異度（98%），2019年《中國非小細胞肺癌ALK檢測臨床實踐專家共識》建議優先應用Ventana-D5F3 IHC進行ALK檢測。
但需要注意的是，ALK Ventana-D5F3 IHC檢測試劑及判讀標準是針對肺腺癌樣本設計的，對于非腺癌患者，在進行ALK Ventana-D5F3 IHC結果判讀時應謹慎，要避免假陽性或假陰性。對于結果不能確定的患者，建議使用其他技術平臺進行復檢。而與之相比，非Ventana D5F3的IHC檢測僅用于ALK初篩[1]。
當懷疑檢測標本有質量問題時，優先應用FISH檢測[1]。但是由于EML4-ALK易位為倒置易位，有些病例中熒光分離信號距離較近，并且在斷裂點附近不穩定，會產生染色體崩塌導致距離更近，加上立體空間位置，可能會造成假陰性判讀結果。所以在進行FISH結果判讀時，對于分離信號腫瘤細胞比例在臨界值附近的病例，判讀應謹慎，并建議使用其他技術平臺進行復檢。
和其他基因（如EGFR、ROS1等）一起檢測時，可以聯合RT-PCR或NGS進行多基因檢測[1]。在進行RT-PCR結果判讀時，對于Ct值在閾值范圍附近的病例，判讀應謹慎，必要時加備注，并建議使用其他技術平臺進行復檢，但需要注意的是RT-PCR對于不常見的ALK融合類型，有可能出現漏檢。
在進行NGS檢測ALK結果判讀時，應充分掌握NGS檢測平臺及試劑的特點和局限性，結合標本情況、檢測質控及測序數據等進行綜合判讀。年輕的、不吸煙的、Ⅳ期女性患者更易發生ALK融合突變，若一種檢測平臺檢測結果為陰性時，可考慮其他平臺復檢[1]。
每種ALK基因的檢測方法都有其優缺點，2020年，中國醫學科學院腫瘤醫院應建明教授團隊在《胸部腫瘤學》雜志發表了一篇針對ALK融合基因分子病理精準檢測的文章[3]，該研究團隊圍繞ALK基因融合的分子檢測優化與規范化開展了一系列的研究，最終結果顯示：
（1）DNA NGS檢出的ALK罕見融合存在無法轉錄翻譯成有功能融合蛋白的可能性；
（2）隨著NGS的廣泛應用，越來越多的ALK罕見融合伴侶被發現，DNA NGS對融合基因的檢測可能存在一些缺陷，實際上多數病例的真正融合伴侶（RNA水平）仍為經典的EML4基因，在真實世界中ALK的融合伴侶種類可能并不多；
（3）所有的ALK相互融合（primary/reciprocal ALK）病例中的5’ALK融合并沒有轉錄翻譯出融合蛋白。
因此，僅依靠DNA NGS檢出的罕見ALK融合斷點來預測靶向治療的療效可能并不準確，對于此類罕見融合患者，聯合應用RNA/蛋白水平的檢測可能會更好地指導后續的精準治療。
ALK抑制劑對伴有ALK基因融合的晚期NSCLC患者顯示出顯著的臨床獲益。選擇準確、快速、恰當的ALK檢測方法，篩選出適用ALK抑制劑的目標人群具有重要臨床意義。ALK Ventana-D5F3 IHC、FISH、RT-PCR、NGS檢測平臺試劑均具有較高的靈敏度及特異度。共識建議優先應用Ventana-D5F3 IHC進行ALK檢測，當和其他基因一起檢測時，可以聯合RT-PCR或NGS進行多基因檢測。
對于少數無法獲得組織學或細胞學樣本的晚期NSCLC患者，專家共識建議嘗試使用血液/腦脊液進行ALK檢測[1]。期待IHC、FISH、RT-PCR和NGS在ALK陽性NSCLC的研究繼續突飛猛進，也期待更多病理和臨床醫生參與到肺癌ALK融合基因研究中來，為更為精準的肺癌診治貢獻力量。
副主任醫師，醫學博士，南京大學醫學院副教授
江蘇省醫學會呼吸分會青年委員。發表SCI論文10余篇，其中以第一作者（含共同第一作者）發表9篇
主持國家自然科學基金青年基金一項，參與國家及省部級課題數項
入選2016江蘇省“科教強衛工程”青年人才， 作為第四完成人獲得2016年教育部科技進步二等獎，作為第五完成人獲得2021年江蘇省科技進步一等獎
掌握常見呼吸系統疾病的診療，主要從事肺癌的基礎和臨床研究
[1] 中國非小細胞肺癌ALK檢測模式真實世界多中心研究專家組,中華醫學會病理學分會分子病理學組.中國非小細胞肺癌ALK檢測臨床實踐專家共識[J].中華病理學雜志,2019,48(12):913-920
2] Mok T, Camidge DR, Gadgeel SM, et al. TEMPORARY REMOVAL: Updated overall survival and final progression-free survival data for patients with treatment-na?ve advanced ALK-positive non-small-cell lung cancer in the ALEX study. Ann Oncol. 2020;S0923-7534(20)39796-9.
[3] Li W, Guo L, Liu Y, et al. Potential Unreliability of Uncommon ALK, ROS1, and RET Genomic Breakpoints in Predicting the Efficacy of Targeted Therapy in NSCLC. J Thorac Oncol. 2021;16(3):404-418.
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